阿司匹林對大鼠炎性痛作用范文

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《中成藥雜志》2015年第六期

1材料與方法

1.1實驗藥物水溶性蜂膠(含14.7%總黃酮，廣州市杰禾蜂業有限公司，批號20121103-A)，按蜂膠總黃酮量200mg/kg對大鼠給藥;完全弗氏佐劑(美國Sigma公司);納洛酮(Naloxone)注射液(北京四環制藥廠，批號20110106);阿司匹林腸溶片(南京白敬字制藥有限責任公司，批號121207)，按100mg/kg對大鼠給藥［9］;非選擇性一氧化氮合酶抑制劑N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME，美國Sigma公司)。

1.2主要儀器與試劑PL-200熱刺痛儀(成都泰盟科技有限公司);BW-YLS-3E電子壓痛儀、YLS-7B足跖容積測量儀(上海軟隆科技發展有限公司);UV-3200PCS紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司);Model-680型酶標儀(美國BIO-RAD公司);BeckmanCoulter微量臺式離心機(美國Beckman公司)。NO試劑盒(南京建成生物工程研究所);PLA2、PGE2、TNF-α、IL-6試劑盒(合肥博美生物科技有限公司);其余試劑均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3實驗動物清潔級雄性SD大鼠48只，體質量(200±20)g，由合肥蜀山實驗動物中心提供，實驗動物合格證號:SCXK(蘇)2009-0001，籠養3～4d后進行行為學測試和實驗，12h～12h明暗周期，室溫20～22℃。動物適應性喂養一周。

1.4試驗方法

1.4.1實驗分組雄性SD大鼠42只，隨機分為7組(n=6):正常對照組(NC組)、炎性痛模型組(CFA組)、炎性痛+水溶性蜂膠組(CFA+WSP組)、炎性痛+阿司匹林組(CFA+P組)、炎性痛+水溶性蜂膠+阿司匹林組(CFA+WSP+P組)、炎性痛+水溶性蜂膠+納洛酮組(CFA+WSP+NAL組)和炎性痛+水溶性蜂膠+非選擇性一氧化氮合酶抑制劑組(CFA+WSP+L-NAME組)。

1.4.2慢性炎性疼痛模型的建立炎性痛模型組(CFA組)，消毒大鼠左側后肢，用1mL注射器抽取150μL弗氏完全佐劑(Completefreund’sadju-vant，CFA內含0.1%滅活結核桿菌;Sigma)，于左側后肢足底皮下注射，注射后按壓數分鐘，以促進藥物擴散。正常對照組(NC組)足底皮下注射150μL生理鹽水，其余操作同炎性痛模型組。

1.4.3水溶性蜂膠在炎性痛模型中的鎮痛作用測定各組大鼠基礎痛閾值，每日相同時間點分別給予炎性痛+水溶性蜂膠組、炎性痛+水溶性蜂膠+納洛酮組及炎性痛+水溶性蜂膠+非選擇性一氧化氮合酶抑制劑組大鼠灌胃WSP(蜂膠總黃酮量200mg/kg)，炎性痛+阿司匹林組(大鼠灌胃1mL阿司匹林(100mg/kg)，炎性痛+水溶性蜂膠+阿司匹林組大鼠灌胃WSP(蜂膠總黃酮量200mg/kg)和阿司匹林水溶液(100mg/kg)1mL，NC組和炎性痛模型組大鼠灌胃等容積的生理鹽水，連續用藥14d;大鼠于炎性痛模型第7天，每日相同時間點，腹腔注射(ip)納洛酮(4mg/kg)為炎性痛+水溶性蜂膠+納洛酮組;腹腔注射(ip)L-NAME(100μg/kg)為炎性痛+水溶性蜂膠+非選擇性一氧化氮合酶抑制劑組，NC組和炎性痛模型組大鼠腹腔注射等體積的生理鹽水為對照，連續給藥7d;其他操作同炎性痛+水溶性蜂膠組，給藥1.5h后，分別用PL-200熱刺痛儀和BW-YLS-3E電子壓痛儀測定各組大鼠的熱痛閾潛伏期和機械痛閾值。

1.5行為學測定

1.5.1一般情況測定觀察動物每天左后肢變化，如有無紅腫，注射部位有無滲液感染等，進食有無影響;觀察步態姿勢，有無舔咬現象及肢體癱瘓功能障礙，每日測定大鼠體質量。

1.5.2足跖容積測定在每天相同時間點，用YLS-7B足跖容積測量儀分別測定正常對照組及炎性痛模型組大鼠的左側足跖的容積。

1.5.3熱刺痛法測試前讓大鼠在較黑暗的環境中適應約5min，待大鼠安靜后，移動熱輻射光源，使其通過透明玻璃板聚焦于大鼠左后趾足底部皮膚，觀察大鼠對熱傷害性刺激的反應。當大鼠出現抬足、舔腳反應時的時間為熱痛閾潛伏期(Ther-malwithdrawallatency，TWL)。當時間達到30s，而大鼠仍無反應時便停止照射，以免損傷皮膚，并以30s作為最高痛閾。每日于給藥后30min測定痛閾，測定時每組循環測定3次，兩次時間間隔大于5min，取3次測定值的均數作為大鼠的熱痛閾潛伏期。

1.5.4機械壓痛法在室溫、安靜狀態下，將大鼠左側后肢足背部置于壓痛儀硅板上，腳踩踏板增加壓爪強度，當大鼠出現縮腿、掙扎、嘶叫時，踩下踏板，此時壓強為機械壓痛閾值(Mechanicalwithdrawalthreshold，MWT)。當機械壓痛質量達到250g，而大鼠仍無反應時便停止壓爪，以免損傷皮膚，并以250g作為最高痛閾。痛閾測定時每組循環測定3次，2次時間間隔大于5min，取3次測定值的均數作為大鼠的機械壓痛閾值。

1.6生化檢測及形態學觀察

1.6.1大鼠血清中IL-6、TNF-α及NO水平的測定于制備炎性痛模型第14天，大鼠頸總動脈取血3～5mL，分離血清，測定其中IL-6、TNF-α及NO水平。

1.6.2大鼠致炎足關節滲出液中PGE2和PLA2水平的測定于制備炎性痛模型第14天，將大鼠處死，在致炎足踝關節上方0.5cm處剪取后足腫脹足爪，縱向切開，放入5mL生理鹽水的試管中，4℃浸泡過夜，以3000r/min離心10min，取上清液，嚴格按照試劑盒說明書采用酶聯免疫吸附法檢測其中PGE2和PLA2的量。

1.6.3大鼠致炎足及肝臟的形態學觀察留取各組大鼠致炎足及肝臟于10%福爾馬林溶液中浸泡，進行HE染色觀察其形態學變化。

1.7數據處理及分析分別以引起機械痛閾的質量數值(g)、熱痛閾的照射時間(s)來表示機械痛閾和熱痛閾。采用SPSS16.0軟件進行統計分析，實驗數據以均數±標準差(x±s)表示，多組均數比較用單因素方差分析(OnewayANOVA)，兩兩比較用S-N-K法，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。采用GraphPadPrism5軟件作圖。

2結果

2.1足跖容積測定炎性痛模型組大鼠左足跖皮下注射完全弗氏佐劑后開始腫脹，足跖容積與正常對照組相比顯著升高(P＜0.01)，直至造模后第14天足跖容積仍高于正常對照組(P＜0.01)。結果表明炎性痛模型構建成功。

2.2各組大鼠機械痛閾值與正常對照組相比，炎性痛模型組大鼠注射完全弗氏佐劑后第1天開始機械痛閾值明顯下降，持續14d仍存在(P＜0.01)，提示炎性痛模型大鼠存在機械痛覺過敏;同炎性痛模型組相比，炎性痛+水溶性蜂膠組、炎性痛+阿司匹林組和炎性痛+水溶性蜂膠+阿司林組大鼠在灌胃給藥第2天后機械痛閾值出現增高，直到造模后第14天差異仍舊存在，差異有顯著性(P＜0.05)。如圖3所見，給各組大鼠腹腔注射用藥前，與正常對照組相比，炎性痛模型組、炎性痛+水溶性蜂膠組、炎性痛+水溶性蜂膠+納洛酮組和炎性痛+水溶性蜂膠+非選擇性一氧化氮合酶抑制劑組大鼠機械痛閾值明顯低于正常對照組(P＜0.05)，與炎性痛模型組相比，炎性痛+水溶性蜂膠組大鼠機械痛閾值明顯增高(P＜0.01);腹腔注射阿片受體阻斷劑納絡酮(NAL)后，炎性痛+水溶性蜂膠+納洛酮組大鼠機械痛閾值增高程度被部分阻斷，同炎性痛+水溶性蜂膠組相比，差異有顯著性，表明腹腔注射阿片受體阻斷劑納絡酮能部分阻斷WSP對炎性痛大鼠的鎮痛作用;腹腔注射非選擇性一氧化氮合酶抑制劑L-NAME后，炎性痛+水溶性蜂膠+非選擇性一氧化氮合酶抑制劑組大鼠機械痛閾值明顯高于炎性痛+水溶性蜂膠組，具有統計學意義(P＜0.01)，表明腹腔注射非選擇性一氧化氮合酶抑制劑L-NAME后，通過減少炎性痛大鼠外周組織NO的生成，從而增強了WSP的抗炎鎮痛效應。見圖3。

2.3各組大鼠熱痛閾值與正常對照組相比，炎性痛模型組大鼠注射弗氏完全佐劑后第1天開始熱痛閾值明顯下降，持續14d仍存在(P＜0.01)，提示炎性痛模型大鼠存在熱痛覺過敏;同炎性痛模型組相比，炎性痛+水溶性蜂膠組、炎性痛+阿司匹林組和炎性痛+水溶性蜂膠+阿司匹林組大鼠在灌胃給藥第2天后熱痛閾值亦明顯增高，直到造模后第14天差異仍舊存在，有顯著性差異(P＜0.05)。給各組大鼠腹腔注射用藥前，與正常對照組相比，炎性痛模型組、炎性痛+水溶性蜂組、炎性痛+水溶性蜂膠+納洛酮組和炎性痛+水溶性膠+非選擇性一氧化氮合酶抑制劑組大鼠熱痛閾值明顯低于正常對照組(P＜0.05)，與炎性痛模型組相比，炎性痛+水溶性蜂膠組大鼠熱痛閾值明顯明顯增高(P＜0.01);腹腔注射阿片受體阻斷劑納絡酮(NAL)后，炎性痛+水溶性蜂膠+納洛酮組大鼠熱痛閾值增高程度被部分阻斷，同炎性痛+水溶性蜂膠組相比，差異有顯著性，表明腹腔注射阿片受體阻斷劑納絡酮能部分阻斷WSP對炎性痛大鼠的鎮痛作用;腹腔注射非選擇性一氧化氮合酶抑制劑L-NAME后，炎性痛+水溶性蜂膠+非選擇性一氧化氮合酶抑制劑組大鼠熱痛閾值明顯高于炎性痛+水溶性蜂膠組，具有統計學意義(P＜0.01)，表明腹腔注射非選擇性一氧化氮合酶抑制劑L-NAME后，通過減少炎性痛大鼠外周組織NO的生成，從而增強了WSP的抗炎鎮痛效應。

2.4水溶性蜂膠聯合阿司匹林對炎性痛大鼠血清中IL-6、TNF-α及NO水平的影響與正常對照組相比，炎性痛模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α及NO水平明顯增高(P＜0.01);同炎性痛模型組相比，炎性痛+水溶性蜂膠組，炎性痛+阿司匹林組和炎性痛+水溶性蜂膠+阿司匹林組大鼠血清中IL-6、TNF-α及NO水平均顯著降低(P＜0.05);同炎性痛+水溶性蜂膠組和炎性痛+阿司匹林組相比，炎性痛+水溶性蜂膠+阿司匹林組大鼠血清中IL-6、TNF-α及NO水平也有明顯降低(P＜0.05)，說明WSP通過抑制炎性痛大鼠外周組織炎性因子的釋放而發揮鎮痛效應，與阿司匹林(P)聯合使用其作用增強，具有協同效應。

2.5水溶性蜂膠聯合阿司匹林對大鼠致炎足關節滲出液中PLA2和PGE2水平的影響與正常對照組相比，炎性痛模型組大鼠致炎足關節滲出液中PLA2和PGE2水平明顯增高(P＜0.01);同炎性痛模型組相比，炎性痛+水溶性蜂膠組、炎性痛+阿司匹林組和炎性痛+水溶性蜂膠+阿司匹林組大鼠患足關節滲出液中PLA2和PGE2水平均降低(P＜0.05);同炎性痛+水溶性蜂膠組和炎性痛+阿司匹林組相比，炎性痛+水溶性蜂膠+阿司匹林組大鼠致炎足關節滲出液中PLA2和PGE2含量明顯降低(P＜0.05)。結果表明WSP具有抑制炎性痛大鼠炎性部位PLA2和PGE2的釋放而發揮鎮痛效應，與阿司匹林(P)聯合使用其作用增強，具有協同效應。

2.6HE染色

2.6.1大鼠足跖部病理變化的組間比較正常對照組大鼠左側足皮下組織結構清晰整齊，無炎性細胞浸潤;炎性痛模型組大鼠致炎足皮下結締組織排列紊亂，大量炎癥細胞浸潤，水腫明顯;炎性痛+水溶性蜂膠組和炎性痛+阿司匹林組大鼠致炎足皮下組織輕微水腫，炎性細胞浸潤減少;炎性痛+水溶性蜂膠+阿司匹林組大鼠致炎足皮下組織排列整齊，無明顯水腫，炎性細胞浸潤減少(見圖6)。

2.6.2各組大鼠肝臟病理變化正常對照組大鼠肝細胞為多邊形，界限較清楚，細胞體積較大，核仁清楚，肝血竇內可見散在巨噬細胞;炎性痛模型組大鼠肝細胞水腫，肝血竇內大量炎性細胞浸潤;炎性痛+水溶性蜂膠組和炎性痛+阿司匹林組大鼠肝血竇內一定量炎性細胞浸潤;炎性痛+水溶性蜂膠+阿司匹林組大鼠肝血竇內少量炎性細胞浸潤(見圖7)。

3討論

炎癥是機體在有害刺激作用下，多種因素導致局部組織細胞損傷的病理過程，也是機體對抗損傷的防御性保護反應。在致炎因素刺激下，細胞膜磷脂酶A2(PLA2)被激活，水解膜磷脂的酯鍵，釋放出花生四烯酸，經環氧合酶作用產生前列腺素，前列腺素E2(PGE2)是其中主要組分，PGE2具有強烈的擴血管作用，從而引起炎癥部位組織水腫，炎性滲出，同時還具有致敏痛覺神經末梢，造成痛覺過敏;多種炎癥介質和細胞因子調控炎癥反應過程，其中一氧化氮(NO)在炎癥反應的許多環節中發揮復雜的調節作用，如在細胞間信息傳遞過程中起信使作用，促炎作用包括舒血管作用，引起炎癥部位組織水腫，增加炎性滲出等;TNF-α是一具有重要生物學功能的細胞因子，能激活血管內皮功能，增加白細胞黏附，激活凝血系統，抑制纖溶，激活單核-巨噬細胞釋放IL-6和PGE2等炎癥介質等多途徑發揮其致炎作用。

疼痛是炎癥的主要癥狀，國際上已經將疼痛列為第五生命體征。疼痛的評定主要有痛閾的測定、疼痛的主體評測和客體評測等［12］。慢性炎性疼痛對患者的工作和生活影響較大，現有臨床各類抗炎藥雖有一定療效，但均因同時具有不同程度的副作用而限制了其對疼痛的有效治療，深入探討炎性疼痛產生的機制，尋求更為有效的治療方法亟待解決。阿司匹林(P)又稱乙酰水楊酸，屬于非甾體抗炎藥，其通過抑制環氧合酶的活性，使前列腺素等炎癥介質生成減少，從而實現其抗炎鎮痛作用，由于其本身具有酸性，造成胃腸道的不良反應，限制了其在臨床上的廣泛應用。蜂膠有“紫色黃金”的美譽［2］，具有多種藥理作用，如抗炎鎮痛和心血管藥理作用等，對蜂膠的抗炎鎮痛作用有諸多報道，對其抗炎機制研究也取得了一定的進展，但對于蜂膠抗炎活性研究的藥物開發卻不盡人意，尤其是在蜂膠與抗炎藥物的相互作用研究較少，對于蜂膠與非甾體抗炎藥的相互作用尚未見報道。

本實驗通過建立炎性痛致炎性疼痛大鼠模型，通過蜂膠總黃酮(200mg/kg)及蜂膠總黃酮(200mg/kg)聯合阿司匹林(100mg/kg)對大鼠灌胃(1次/d)，連續14d，采用熱痛法和機械壓痛法，測定各組大鼠熱痛閾潛伏期和機械壓痛閾值變化;實驗結果顯示，與正常對照組相比，炎性痛模型組大鼠注射弗氏完全佐劑后第1天開始MWT和TWL均明顯下降，持續14d仍存在，提示炎性痛模型大鼠存在機械痛覺和熱痛覺過敏，血清中IL-6、TNF-α及NO水平明顯增高，患足關節滲出液中PLA2和PGE2水平明顯增高;同炎性痛模型組相比，炎性痛+水溶性蜂膠組、炎性痛+阿司匹林組和炎性痛+水溶性蜂膠+阿司匹林組大鼠在灌胃給藥第2天后MWT和TWL均出現增高，直到造模后第14天差異仍舊存在，血清中IL-6、TNF-α及NO水平明顯降低，大鼠患足關節滲出液中PLA2和PGE2水平明顯降低，差異有顯著性;大鼠足跖部和肝臟形態學檢測顯示，同炎性痛模型組相比，炎性痛+水溶性蜂膠組、炎性痛+阿司匹林組和炎性痛+水溶性蜂膠+阿司匹林組大鼠足跖部皮下組織炎性細胞浸潤明顯減少，水腫減輕;大鼠肝血竇內炎性細胞浸潤明顯減少，肝細胞水腫明顯減輕。給各組大鼠腹腔注射用藥前，與正常對照組相比，炎性痛模型組、炎性痛+水溶性蜂膠組、炎性痛+水溶性蜂膠+納洛酮組和炎性痛+水溶性蜂膠+非選擇性一氧化氮合酶抑制劑組大鼠MWT和TWL均明顯低于正常對照組，與炎性痛模型組相比，炎性痛+水溶性蜂膠組大鼠MWT和TWL均明顯增高;腹腔注射阿片受體阻斷劑納絡酮(NAL)后，炎性痛+水溶性蜂膠+納洛酮組大鼠MWT和TWL增高程度均被部分阻斷，同炎性痛+水溶性蜂膠組相比，差異有顯著性，表明腹腔注射阿片受體阻斷劑納絡酮能部分阻斷WSP對炎性痛大鼠的鎮痛作用;腹腔注射非選擇性一氧化氮合酶抑制劑后，炎性痛+水溶性蜂膠+非選擇性一氧化氮合酶抑制劑組大鼠MWT和TWL均明顯高于炎性痛+水溶性蜂膠組，具有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)，表明腹腔注射非選擇性一氧化氮合酶抑制劑L-NAME后，通過減少炎性痛大鼠外周組織NO的生成，從而增強了WSP的抗炎鎮痛效應。總而言之，實驗結果同樣證實WSP對炎性痛大鼠有明顯的抗炎鎮痛作用，聯合阿司匹林后，其抗炎鎮痛作用明顯增強，其機制可能是抑制細胞因子及炎性介質的產生，降低炎癥部位組織PLA2和PGE2的產生而實現的，阿片受體途徑可能也發揮一定的作用。

作者：王海華 王海珍 曾瑾 姜玉新 王靜 周萍萍 單位：皖南醫學院生理教研室