單糖組成測定影響因素范文

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《中國海洋藥物雜志》2016年第二期

摘要：

目的研究不同因素對三斑海馬多糖（HTP）降解的影響，探求適合其單糖組成測定的降解條件。方法通過設計正交實驗，采用三氟乙酸（TFA）對HTP進行降解，結合1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PMP）柱前衍生高效液相色譜進行單糖組成分析，比較各實驗的降解情況。結果HTP中主要含有Man、GlcN、Gal和少量的GalN、Glc、GlcA、Ara、Fuc共8種單糖。在考察條件范圍內，溫度和時間是影響單糖組成分析的主要因素，酸濃度是次要因素。HTP中各單糖的最適降解條件是：氨基糖GlcN和GalN為120℃，6h，4mol／LTFA；中性糖Man、Glc和Gal為110℃，4h，3mol／LTFA；糖醛酸GlcA及Ara、Fuc為100℃，2h，3mol／LTFA。通過對10種單糖標準品的降解也發現氨基糖（GlcN和GalN）較穩定，糖醛酸（GlcA和GalA）穩定性差。結論HTP中不同結構類型的單糖對降解條件的敏感度不同：糖醛酸易降解釋放，但也易被破壞；氨基糖較難降解，但降解后較為穩定；中性糖的降解難易和穩定性介于兩者之間。采用同一條件降解不能準確地測定HTP的單糖組成，需要針對不同結構類型單糖的性質采用不同的條件進行降解。

關鍵詞：

三斑海馬；多糖；單糖組成；柱前衍生；降解條件

海馬作為中國名貴的海洋中藥材，具有溫腎壯陽，散結消腫等功效，常用于陽痿、遺尿、跌撲損傷、瘕瘕積聚、腎虛作喘及外治癰腫疔瘡等［1］。在中國，海馬具有悠久的藥用歷史，《本草綱目》中記載：“海馬，主難產及血氣痛；暖水臟，壯陽道；消癮塊，治療腫毒”［2］。現代藥理學研究表明，海馬中含有豐富的蛋白質、氨基酸、多種脂肪酸、甾醇類化合物、磷脂和微量元素等成分，使其不僅具有激素樣作用和增強造血功能，還在抗腫瘤、抗衰老和抗疲勞等方面發揮了重要作用［3－5］。根據文獻記載，現全世界已知海馬有近45種，產于中國沿海的至少有13種［6］。其中三斑海馬是最為常見的1種，主要分布在廣東、福建和海南沿海地區［7］。三斑海馬，俗名龍落子，是刺魚目海馬屬海洋生物，因頭與軀干成直角，形似馬頭，體側背方第1、4、7節各具一大黑斑，故得名。海馬多糖作為海馬體內1種重要的組成成分，鮮見其報道；因其單糖組成相對復雜，同時含有不同結構類型的氨基糖、中性糖和糖醛酸，很難采用單一條件對其單糖組成進行準確定量分析，這也為海馬多糖的深入研究造成了困難。本實驗首次通過正交實驗設計，對三斑海馬多糖的單糖組成測定的影響因素進行了較為系統的研究，以期探索適合其復雜單糖組成測定的降解條件。

1材料、試劑與儀器

三斑海馬多糖（HTP），本實驗室提取；三氟乙酸（TFA），上海展云化工有限公司；1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PMP），甘露糖（Man）、鼠李糖（Rha）、葡萄糖醛酸（GlcA）、半乳糖醛酸（GalA）、氨基半乳糖（GalN）、木糖（Xyl）、葡萄糖（Glc）、氨基葡萄糖（GlcN）、巖藻糖（Fuc）及半乳糖（Gal）10種單糖標準品，美國Sigma－Aldrich公司；甲醇，天津科密歐化學試劑有限公司；ZorbaxBondysilPC－C18色譜柱（4．6mm×150mm，5μm），中冉科技發展有限公司。1260型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；PH070型干燥箱，上海益恒實驗儀器有限公司；MTN－2800D氮吹濃縮裝置，天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

2實驗方法

2．1HTP降解的正交實驗選取降解溫度（A）、時間（B）和TFA濃度（C）3個因素，分別在A為100、110和120℃，B為2、4和6h，C為2、3和4mol／L3個水平下按L9（33）正交表進行實驗組合。準確稱取HTP5mg，置于5mL安瓿瓶中，加入1mL相應濃度的TFA，封口后按照相應的條件進行降解［8－10］，降解完畢，使用氮吹儀除去TFA。

2．2降解液的柱前衍生化將各降解液用氮氣吹干后，用1mL蒸餾水溶解，取100μL溶液（10mg／mL），加入100μLNaOH溶液（0．3mol／L），再加入120μLPMP（0．5mol／L）甲醇溶液，漩渦震蕩混合均勻，置于70℃水浴中衍生1h。衍生完畢，加110μL鹽酸溶液（0．3mol•L－1）中和后，加入500μL氯仿充分震蕩，離心，除去有機相，反復萃取3遍，取上清液過0．22μm微孔濾膜，待用［11］。

2．3高效液相色譜（HPLC）分析對PMP衍生后的降解液采用HPLC分析，比較各色譜峰的峰面積變化情況，確定適合單糖組成測定的降解條件。色譜條件為：ZorbaxBondys－ilPC－C18色譜柱（4．6mm×150mm，5μm）；流動相：磷酸鹽緩沖液（pH＝6．7）／乙腈（82∶18，體積分數）；流速：1．0mL／min；柱溫：30℃；進樣：20μL；檢測器：紫外檢測器（VWD）；檢測波長：245nm［12］。2．4單糖標準品的對照分析選取10種不同結構類型的單糖標準品，經等摩爾質量混合后，采用2mol／LTFA在110℃下分別降解2、4和6h，通過PMP柱前衍生HPLC法考察單糖的含量變化情況。

3實驗結果和討論

3．1HTP的單糖組成定性分析采用文獻報道中單糖組成測定最常用的降解條件，即采用2mol／LTFA在110℃降解4h后［13－14］，采用PMP柱前衍生HPLC法進行單糖組成分析。經與10種單糖對照品的保留時間進行對比（見圖1），發現HTP中的單糖組成較為復雜，主要含有Man、GlcN、Gal和少量的GalN、Glc、GlcA、Ara、Fuc共8種單糖。

3．2降解因素對HTP單糖組成測定的影響為了考察不同降解因素對HTP單糖組成測定結果的影響，本研究選取了降解溫度（A）、降解時間（B）和TFA濃度（C）3個因素，以國內外多糖結構研究文獻報道中最常用的單糖組成測定降解條件，即以2mol／LTFA在110℃降解4h為參考，分別在A為100、110和120℃，B為2、4和6h，C為2、3和4mol／L3個水平下采用L9（33）正交實驗設計進行了考察。8種單糖的峰面積變化情況見表1。對表2的實驗結果采用方差法進行分析，結果表明各因素對GalN降解率的影響程度依次為：溫度（A）＞時間（B）＞TFA濃度（C），溫度和時間是影響單糖組成分析的主要因素，TFA濃度是次要因素；其最適降解條件為：A3B3C3，即降解溫度為120℃，降解時間為6h，TFA濃度為4mol•L－1。采用與GalN相同的分析方法對正交實驗結果進行分析和綜合比較，得出HTP中不同結構類型單糖組成測定的最適降解條件為：1）對氨基糖（GlcN和GalN）測定時，最適降解條件為120℃，6h，4mol／LTFA；2）對中性糖（Man、Glc和Gal）測定時，最適降解條件為110℃，4h，3mol／LTFA；3）對糖醛酸GlcA及Ara、Fuc測定時，最適降解條件為100℃，2h，3mol／LTFA。由此可見，不同結構類型的單糖對降解條件的敏感程度不盡相同。其中，氨基糖（GlcN和GalN）難被降解，對降解條件要求較高，而糖醛酸GlcA和Ara、Fuc較易降解釋放，對降解條件的要求較低。常見的中性糖Man、Glc和Gal對降解條件的要求介于兩者之間，即采用目前文獻報道最常用的降解方法可以使它們很好地被降解和釋放。因此，為準確測定HTP的單糖組成，需根據不同結構類型單糖最適的降解條件，分別進行降解和定量分析。

3．3單糖標準品的對照分析結果為了探究不同結構類型的單糖在降解條件下的穩定性，文中進一步選用了10種常見的單糖標準品進行了對照降解和分析考察。10種常見的單糖標準品采用文獻中最常用的2mol／LTFA在110℃降解2、4和6h，其實驗結果如表3。從表3可以看出，10種單糖標準品在降解過程中均有不同程度的損失，并且隨降解時間的增加，其損失率也隨之升高。從各單糖的降解損失率可以看出，氨基糖（GlcN和GalN）在選用的降解條件下較為穩定，損失率較低（在降解6h后損失率約為20％）；糖醛酸（GlcA和GalA）穩定性較差，易被破壞，損失率較高（在降解6h后損失率均高達50％以上）；其它中性糖（Man、Glc和Gal）的損失率（在降解6h后損失率約為30％～35％）略高于氨基糖，但較糖醛酸穩定，這與HTP的單糖組成測定影響因素考察結果較為吻合。但從HTP單糖組成測定的影響因素考察和10種單糖標準品的對照分析實驗結果可以看出，多糖中單糖降解釋放的難易程度和游離單糖的穩定性不存在直接必然的聯系，并非完全是越容易被降解釋放的單糖，其在降解條件下的穩定性就越差。例如，Fuc在HTP中較易被降解釋放，但在選用的降解條件下卻較為穩定（在降解6h后損失率為23．9％，接近于氨基糖），這可能與Fuc在海馬多糖中的糖苷鍵連接方式相關。GlcA雖然在HTP中較易被降解釋放，然而在硫酸軟骨素中的GlcA可與N－乙酰基半乳糖形成耐酸降解的二糖單元，不容易被完全釋放［15］，但GlcA一旦被釋放出來，就容易被破壞（見表3）。另外有文獻報道，麥芽糖（Glcα（1→4）Glc）和異麥芽糖（Glcα（1→6）Glc）雖然都是α－構型的二糖，但因兩者的糖苷鍵連接方式不同，其相對水解速率分別為100和31；麥芽糖（Glcα（1→4）Glc）和纖維二糖（Glcβ（1→4）Glc）雖然都是（1→4）糖苷鍵，但因兩者的構型不同，其相對水解速率分別為100和40［16］。因此，多糖中單糖降解釋放的難易程度不僅與結構類型相關，還可能與糖苷鍵的連接方式和α／β構型等相關，但與單糖的穩定性不直接相關。因為多糖一旦降解為單糖，其糖苷鍵連接方式的影響因素就不存在了。

4結論

HTP的單糖組成較復雜，主要由Man、GlcN、Gal及少量GalN、Glc、GlcA、Ara、Fuc共8種單糖組成。不同結構類型的單糖對降解條件的敏感度各不相同：HTP中氨基糖較難降解釋放，Ara、Fuc和GlcA易被降解，常見中性糖Man、Gal和Glc的降解釋放難易程度介于前兩者之間。各單糖在降解過程中的穩定性也存在較大差異（穩定性：氨基糖＞中性糖＞糖醛酸），但多糖中單糖降解釋放的難易程度和游離單糖的穩定性不存在必然的聯系。因此，采用同一條件降解不能正確測定HTP這類結構較為復雜多糖中的單糖組成，為了保證定量分析的準確性，需要針對氨基糖、中性糖、糖醛酸等不同結構類型的單糖性質，分別采用不同的最適降解條件進行綜合測定。

作者：王清池 趙峽 鄧世明 單位：中國海洋大學 海洋藥物教育部重點實驗室 山東省糖科學與糖工程重點實驗室 海南大學海洋學院