棘豆內生真菌種群多樣性探討范文

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《中國獸醫學報》2014年第七期

1材料與方法

1．1植物樣品樣品采自為青海省祁連縣。祁連縣位于青海省海北藏族自治州境北部，東、北部與甘肅省接壤，縣境內草場遼闊，總面積為117．6萬hm2，占全縣土地面積的80％，屬大陸性高寒山區氣候，年均氣溫1℃，年降水量為270～600mm。本次試驗所用植物樣品為2012年8月采集的甘肅棘豆莖和葉，采集后立即用變色硅膠脫水并避光保存備用。

1．2培養基本次試驗所用的2種培養基均為本實驗室自配，具體配方如下：馬鈴薯糖瓊脂培養基（Potatodextroseagar，PDA）：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1000mL。豆芽糖瓊脂培養基（Beansproutsdextroseagar，BDA）：黃豆芽100g，瓊脂15g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL。

1．3主要儀器與試劑DNA聚合酶等分子生物學試劑，均購自TaKaRa公司；PCR基因擴增儀，購自美國Bio－Rad公司；瓊脂糖購自美國SIGMA公司；膠回收試劑盒購自于北京天根生化科技有限公司；南京金斯瑞公司完成測序；恒溫培養箱購自上海精宏實驗設備有限公司；有機試劑均為國產分析純；提取DNA所用CTAB溶液為本實驗室自配。

1．4內生真菌分離與純化表面消毒組織塊分離法分別將甘肅棘豆的莖和葉用蒸餾水沖洗干凈，經75％乙醇漂洗30s、無菌水沖洗3次、有效氯為2％次氯酸鈉漂洗3～5min、無菌水沖洗3～5次后，再將葉剪成約5mm×5mm小塊，莖剪成約3～5mm小段，然后分別置PDA和BDA平板上，在黑暗和光照條件下于室溫下培養，定時觀察。為檢查表面消毒是否徹底，在對照平板上作無菌水和組織印跡檢測，若平板無任何菌生長，證明表面消毒效果良好。待組織塊切口處長出菌絲后，挑取頂端菌絲轉接至新的培養基上，然后繼續采用尖端挑取法純化2～3次，將純化后的菌株編號，隨后將菌株接種至試管斜面，4℃冰箱保存備用。另將純化編號的菌株刮取菌絲用于提取其總DNA。

1．5內生真菌種屬鑒定及遺傳進化分析

1．5．1形態學鑒定采用插片法，即將洗凈滅菌的蓋玻片斜插于培養基中，使菌絲自然生長于蓋玻片上，然后取出載玻片，制作臨時裝片，以對分離得到的內生真菌進行顯微形態觀察，根據其菌絲顏色、孢子形態、產孢結構及有無橫隔等特征，參照《真菌鑒定手冊》對其進行初步鑒定。

1．5．2分子生物學鑒定將刮取的菌絲稱重后置于離心管中，利用改良CTAB法［15］提取基因組DNA并作為模板，以真菌rDNA擴增的通用引物ITS1（5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGC－3′）和ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）為上、下游引物［16］，擴增其核糖體rDNA－ITS保守序列，目的片段經膠回收試劑盒回收純化后，送交測序公司測序。

1．5．3系統發育樹構建將測得的序列利用Blast工具與GenBank中5．8SrDNA－ITS序列進行同源性比對，利用Mega5．0軟件分析，采用N－J法構建系統發育樹，自展次數為1000次。根據系統發育樹中組群關系并結合形態學觀察結果確定菌株屬種。

1．6多樣性計算生物多樣性測定主要有3個空間尺度：α多樣性、β多樣性和γ多樣性。α多樣性主要關注局域均勻生境下的物種數目，因此也被稱為生境內的多樣性（Within－habitatdiversity）；β多樣性指沿環境梯度不同生境群落之間物種組成的的相異性或物種沿環境梯度的更替速率，也被稱為生境間的多樣性（Between－habitatdiversity）；γ多樣性描述區域或大陸尺度的多樣性，是指區域或大陸尺度的物種數量，也被稱為區域多樣性（Regionaldiversity）。本試驗由于只涉及到生境內多樣性，故選用α多樣性。常用的α多樣性指數有香農－維納指數（Shannon－WeinerIndex，H）、辛普森多樣性指數（Simpson’diversityindex，D）等。通常情況下，草類植物內生真菌多樣性多使用香農－維納指數分析［17］。為確保分析結果可靠，本次試驗除選用香農－維納指數外，還選用辛普森多樣性指數和均勻度指數（Evennessindex，J）進行多樣性分析。其計算公式分別為：H＝－S（Pi）（lnPi）、D＝1－S（Pi）2，式中Pi均為屬于種i的個體在全部個體中的比例；J＝H／lnS，式中H為辛普森指數、S為物種總數目。

2結果

2．1內生真菌的分離與鑒定在不同的培養條件下，629塊植物組織樣品共分離得到433株內生真菌，總分離率為68．84％。其中，莖的分離率為83．03％（230／277），葉的分離率為57．67％（203／352），兩者差異顯著。其中，不同的培養條件分離率不同，黑暗培養條件下分離率為72．54％，光照培養條件下為66．49％，PDA培養基上為72．70％，BDA培養基上為65．23％。分離所得的433株內生真菌經形態學和分子生物學鑒定分屬于10科17屬28種，有11株在培養過程中未產生菌絲或菌絲量極少，無法確定其種屬。不同的培養條件下分離種類不同，黑暗培養條件下分離種類為21種，光照培養條件下為14種，PDA培養基上為15種，BDA培養基上為20種。表1列舉了本次試驗分離得到的全部菌株種屬分布及分離率統計。總體而言，Undi－filumOxytropis為優勢菌株。

2．2內生真菌系統發育分析由圖1可以看出，分離所得的內生真菌根據進化親緣關系可分為種群Ⅰ和種群Ⅱ，種群Ⅰ又可進一步分為種群A、種群B、種群C和種群D，種群A和B的自檢支持率分別為95％和97％，種群Ⅱ即為種群E。種群A部分內生真菌親緣關系較低，自檢支持率分別為26％。顯微觀察結果顯示，種群A、種群B和種群C中的鏈格孢屬（Alternaria）為深色有隔菌，種群C剩余部分、種群D和種群E為淺色有隔菌。

2．3內生真菌種群多樣性指數計算將分離所得的菌株數量轉換成矩陣，通過多樣性指數計算公式進行香農－維納指數、辛普森多樣性指數和豐富度指數的計算。結果顯示，香農－維納指數（H）為1．99，均勻度指數（E）為0．60；辛普森指數（D）為0．257.

3討論

路浩等［18］從采集自青海和內蒙的5種瘋草中分離得到小雙胞腔菌、層出鐮刀菌、擬青霉菌、子囊菌、球狀莖點霉菌、細鏈格孢菌、磚紅鐮刀菌、三線鐮刀菌、焦曲霉和褶皺裸孢殼菌10種內生真菌，趙清梅等［19］從寧夏苦馬豆中分離得到枝頂孢屬及未定屬4種內生真菌，陳基萍等［20］從小花棘豆、黃花棘豆、甘肅棘豆、急彎棘豆、蘭花棘豆和變異黃芪中分離得到38種內生真菌，分屬于12科19屬，可見我國瘋草內生真菌種類豐富。但是，前人的研究只使用了1種培養基（PDA），本次試驗中使用PDA和BDA（豆芽糖瓊脂培養基）2種培養基，結果發現PDA上共分離得到15種內生真菌，BDA上則為20種，特別是在慢生型內生真菌方面，BDA更具優勢。這可能是因為BDA培養基營養更加貧乏，快生型內生真菌生長受到了一定程度的抑制。本次試驗使用了不同的培養條件（黑暗和光照）以及不同培養基（PDA和BDA），因此分離得到了更多的內生真菌（28種）。內生真菌在宿主植物內經過長期的進化和演變，其形態學特征必然發生某些改變以便適應宿主植物提供的內生環境，而且內生真菌已經適應植物組織內部的特殊生長環境因而對新的培養環境比較敏感，因此，在研究多樣性方面，使用不同的培養條件是非常有必要的。本試驗發現甘肅棘豆內生真菌優勢菌株為UndifilumOxytropis，這與國外的研究相似。國外有研究表明［21］，在缺水和缺鉀等條件下，UndifilumOxytropis的含量有所增加。本試驗樣品采集地位于青海省祁連縣，屬大陸性高寒山區氣候，年均氣溫1℃，年降水量為270～600mm，氣候惡劣，UndifilumOxytropis能增加瘋草的抗性，因此分離出來的數量更多。通過構建內生真菌系統發育樹發現，有些樹枝上自檢支持率比較低。一般來說，自檢支持率大于50％，則數值會被繪制在發育樹上，而自檢支持率小于50％和任何指定的下界之間，則數值將以表格輸出來決定。對每個種的內生真菌顯微觀察結果可知，在半干旱草原中，深色有隔菌株占優勢地位，這與Khidir等［22］的研究結果相似。在進化樹中，與UndifilumOxytropis相近的種屬為Alternaria和Macrospora。相對而言，Alternaria屬（鏈格孢屬）研究較多。鏈格孢屬真菌廣發分布于自然界，可在低溫潮濕的環境下生長繁殖，可產生70多種有毒代謝產物鏈格孢毒素［22］，這些毒素對UndifilumOxytropis合成苦馬豆素是否有影響，還有待進一步的研究。多樣性指數中，香農－維納指數用來估算群落多樣性的高低，當群落中只有1個居群存在時，香農－維納指數達最小值0，當群落中有2個以上的居群存在，且每個居群僅有1個成員時，指數達到最大值lnk；均勻度指數用來描述物種中的個體的相對豐富度或所占比例；辛普森指數也是用來估算群落多樣性的高低，當全部個體屬于1個種的時候辛普森指數為最小值0，當個體屬于分別屬于不同種的時候辛普森指數達最大值Dmax。與香農－維納指數相比，稀有物種在辛普森指數中所起作用較小，而普遍物種所起的作用較大。本試驗中香農－維納指數（H）為1．99，均勻度指數（E）為0．60，辛普森指數（1／D）為0．257。目前國內外尚無瘋草內生真菌多樣性指數的研究報道，因此無法與瘋草類植物內生真菌多樣性指數相比。與類似氣候條件相比（半干旱草原），瘋草內生真菌多樣性較低=。原因可能有：首先，研究植物不相同；其次，Khidir等=和Porras－Alfaro等=研究的是根部，而本試驗是甘肅棘豆的莖和葉部；再次，植物內生真菌多樣性與地區、氣候、海拔等=有關，盡管兩地的氣候條件相似，但是海拔等因素略有差異，因此指數有所差異。為更好的研究甘肅棘豆內生真菌種群多樣性，為今后的更進一步研究奠定基礎，有必要采集更多的樣品，通過多次重復分離來獲得更多可培養內生真菌，只有這樣，才能更好的分析其多樣性，從而更好地了解甘肅棘豆及其內生真菌與生態環境之間的關系。本試驗對甘肅棘豆內生真菌多樣性進行分析，并進行多樣性指數的計算，其結果可為今后深入探討不同地域研究甘肅棘豆內生真菌多樣性提供理論依據，也為進一步闡明我國甘肅棘豆內生真菌種群分布特征及遺傳多樣性奠定基礎，為產苦馬豆素菌株的篩選提供了豐富的后備菌株。

作者：路浩李國中楊曉雯曹丹丹薛瑞旭權海云趙寶玉單位：西北農林科技大學動物醫學院內蒙古阿拉善左旗獸醫站