流產(chǎn)組織物的遺傳學(xué)分析范文

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摘要:

目的分析胚胎絨毛染色體異常情況與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)之間的臨床關(guān)系。方法選擇2012年2月－2014年2月于河北省人民醫(yī)院優(yōu)生優(yōu)育優(yōu)教中心和婦產(chǎn)科門診擬行流產(chǎn)的孕12周內(nèi)孕婦共149例，分為4組，即正常組30例，病例1組36例，病例2組40例，病例3組43例。應(yīng)用絨毛染色體細(xì)胞培養(yǎng)G顯帶分析技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、高通量全基因組DNA測序技術(shù)等3種方法對絨毛細(xì)胞進(jìn)行染色體檢查。結(jié)果149例樣本中共有55例染色體異常核型，異常核型中三體綜合征占65.45%，以5－三體、16－三體、22－三體多見，Turner綜合征占12.73%，結(jié)構(gòu)異常占10.91%;正常組染色體異常率明顯低于其他3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為14.46、22.32和8.25，P＜0.01)。病例1組和病例2組染色體異常率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.29，P＞0.05)。病例1組和病例2組染色體異常率明顯高于病例3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為2.7、6.27，P＜0.05);發(fā)生2次自然流產(chǎn)的胚胎染色體異常率最高，隨著自然流產(chǎn)次數(shù)增加，胚胎染色體異常率反而呈下降趨勢。結(jié)論該研究通過絨毛染色體細(xì)胞培養(yǎng)G顯帶分析技術(shù)、FISH、高通量全基因組DNA測序技術(shù)等對比研究，建立了一套臨床醫(yī)生如何科學(xué)地選擇絨毛染色體檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)，有效指導(dǎo)臨床。

關(guān)鍵詞:

復(fù)發(fā)性流產(chǎn);染色體分析;熒光原位雜交技術(shù);高通量全基因組DNA測序技術(shù)

自然流產(chǎn)是患病率呈逐年上升趨勢的婦產(chǎn)科常見疾病，占臨床確診妊娠的15%～20%。自然流產(chǎn)的病因復(fù)雜多樣，以胚胎染色體異常為主要病因。因此，本研究選用絨毛染色體細(xì)胞培養(yǎng)G顯帶分析技術(shù)、熒光原位雜交技術(shù)(FISH)、高通量全基因組DNA測序技術(shù)等3種方法對絨毛細(xì)胞進(jìn)行染色體檢查，不僅可以對自然流產(chǎn)的病因做出遺傳學(xué)的判斷，還可以為臨床婦產(chǎn)科工作者提供如何選用合適的絨毛染色體檢測方法提供可靠的指導(dǎo)。

1資料與方法

1.1研究對象選擇2012年2月－2014年2月于河北省人民醫(yī)院優(yōu)生優(yōu)育優(yōu)教中心和婦產(chǎn)科門診擬行流產(chǎn)的孕12周內(nèi)孕婦共149例，年齡20～35歲，平均(29.3±0.4)歲。研究對象分為4組:正常妊娠且無流產(chǎn)史擬行人工流產(chǎn)術(shù)的孕婦30例(正常組);第1次發(fā)生胚胎停止發(fā)育的孕婦36例(病例1組);2次胚胎停止發(fā)育或自然流產(chǎn)史的孕婦40例(病例2組);3次或3次以上胚胎停止發(fā)育或自然流產(chǎn)史的孕婦43例(病例3組)。

1.2絨毛染色體的檢測方法常規(guī)絨毛組織制片、G顯帶、顯微鏡下染色體核型分析。1.3絨毛組織的熒光原位雜交具體步驟按試劑盒 說明進(jìn)行標(biāo)本預(yù)固定、變性雜交。由北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司提供FISH試劑盒，包括GLP13/GLP21(定位于13q14/21q22)、GLP16/GLP22(定位于16q22/22q11.2)、CSP18/CSPX/CSPY。熒光信號判斷:Olympus熒光顯微鏡下觀察，對于正常的絨毛細(xì)胞、GLP13(綠色)/GLP21(紅色)及GLP16(紅色)/GLP22(綠色)探針組雜交后可檢測到2個綠色和2個紅色信號;CSP18(天藍(lán)色)/CSPX(綠色)/CSPY(紅色)探針組可檢測到2個天藍(lán)色、1個綠色和1個紅色信號(男性)，或2個天藍(lán)色、2個綠色信號(女性)。

1.4流產(chǎn)組織染色體異常的高通量全基因組DNA測序技術(shù)檢測樣品準(zhǔn)備及DNA提取:取流產(chǎn)的胎兒絨毛組織100mg，用PBS清洗，通過QiagenQIAampDNAMini試劑盒提取全基因組DNA，并對提取的樣品進(jìn)行質(zhì)控檢測;文庫構(gòu)建打斷:采用Covaris打斷法，將樣品DNA打碎至250bp大小的片段;末端修復(fù):使用T4DNAPolymerase、KlenowDNAPolymer-ase和T4PolynucleotideKinase將打斷形成的黏性末端修復(fù)成平末端;末端加“A”:通過3＇端加堿基“A”，使得DN段能與3＇端帶有“T”堿基的特殊接頭連接，過程中用磁珠法選擇需回收的目的片段產(chǎn)物;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR):使用PCR技術(shù)(10個循壞)擴(kuò)增兩端帶有接頭的DN段;上述步驟反應(yīng)后的DNA使用PCRPurificationSystem60mlkit回收，用等體積的AmpureBeads進(jìn)行純化;Pooling構(gòu)建好的文庫經(jīng)Agilent2100Bioanalyzer及實時定量基因擴(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)(QPCR)檢測合格后，將一定量的文庫按照等物質(zhì)的量混合;上機(jī)測序(Hiseq2000)后進(jìn)行信息分析。

2結(jié)果

2.1絨毛染色體細(xì)胞培養(yǎng)G顯帶分析技術(shù)檢測結(jié)果本研究共納入149例研究對象，其中正常組30例，病例1組36例，病例2組40例，病例3組43例。正常組30例均為新鮮有活力絨毛，故全部采納絨毛染色體細(xì)胞培養(yǎng)G顯帶分析技術(shù)檢測，培養(yǎng)成功率100%。其中僅1例為21－三體(3.33%);其余全部為正常核型(96.67%);其余3組均為胚胎停止發(fā)育患者，大部分絨毛組織不新鮮，采用絨毛染色體細(xì)胞培養(yǎng)G顯帶分析技術(shù)+FISH檢測方法，或直接采用流產(chǎn)組織染色體異常的高通量全基因組DNA測序技術(shù)檢測，以確保檢測成功率達(dá)100%。共48例進(jìn)行絨毛染色體細(xì)胞培養(yǎng)G顯帶分析技術(shù)檢測，培養(yǎng)成功43例(89.58%)，失敗5例(10.42%)。失敗標(biāo)本中，1例因細(xì)胞不貼壁生長，4例未見分裂象;貼壁細(xì)胞生長，單細(xì)胞狀態(tài)差，絨毛組織已老化。成功進(jìn)行染色體核型分析的患者中，核型正常18例(41.86%)，核型異常25例(58.14%);未成功的5例均加做FISH檢測。

2.2絨毛組織細(xì)胞的FISH檢測結(jié)果選取了9例進(jìn)行絨毛染色體細(xì)胞培養(yǎng)G顯帶分析技術(shù)+FISH檢測。9例絨毛中均顯示了FISH檢測信號，檢測成功率為100%。6例絨毛組織中，應(yīng)用3組FISH探針檢測信號與正常組相同，未檢測出異常信號。還有3例絨毛組織中檢測到了FISH異常信號，包括1例三倍體;1例顯示21號染色體均有3個雜交信號，2個X信號;1例18號染色體3個雜交信號，1個X信號，1個Y信號。

2.3流產(chǎn)組織染色體異常的高通量全基因組DNA測序技術(shù)檢測結(jié)果選取了65例病例組絨毛組織進(jìn)行絨毛組織高通量全基因組DNA測序技術(shù)檢測，檢測成功率達(dá)100%。其中26例異常:16－三體6例;5－三體5例;22－三體5例;21－三體1例;13－三體3例;4－三體2例;6－三體1例;45，X03例。

2.4綜合絨毛染色體細(xì)胞培養(yǎng)G顯帶分析技術(shù)、FISH、高通量全基因組DNA測序技術(shù)檢測結(jié)果綜合3種方法發(fā)現(xiàn)149例樣本中共有55例染色體異常核型，異常核型中三體綜合征占65.45%，以5－三體、16－三體、22－三體多見，Turner綜合征占12.73%，結(jié)構(gòu)異常占10.91%。4組染色體情況顯示，正常組30例中僅1例為13－三體，染色體異常率為3.33%;病例1組染色體異常率44.44%;病例2組染色體異常率57.50%;病例3組染色體異常率34.88%。正常組染色體異常率明顯低于其他3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.46、22.32、8.25，P＜0.01);病例1組和病例2組染色體異常率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=1.29，P＞0.05);病例1組和病例2組染色體異常率明顯高于病例3組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.7、6.27，P＜0.05)。

3討論

妊娠早期的自然流產(chǎn)現(xiàn)已上升為臨床婦產(chǎn)科工作中遇到的最常見的疾病之一，患病率逐年上升且病因復(fù)雜。胚胎染色體異常為誘發(fā)自然流產(chǎn)的一個主要原因［1］，同時為出生缺陷的主要危險因素。絨毛細(xì)胞和胚胎組織的遺傳信息相同，它由受精卵有絲分裂產(chǎn)生，故可以作為檢查胚胎染色體的標(biāo)本［2］。絨毛細(xì)胞染色體檢查能夠幫助臨床醫(yī)生了解胚胎染色體的情況，查找出自然流產(chǎn)的病因，為診療工作提供依據(jù)。目前檢查絨毛染色體的方法常用以下5種:絨毛染色體細(xì)胞培養(yǎng)G顯帶分析技術(shù)、FISH、熒光定量PCR(QF－PCR)、高通量全基因組DNA測序技術(shù)、微陣列比較基因組雜交技術(shù)(Array－CGH)。1983年Simoni等［3］采用直接法首次成功制備了人工流產(chǎn)絨毛染色體，1986年Hansmann等［4］將其用于自然流產(chǎn)的檢查取得了良好的效果，之后逐漸廣泛應(yīng)用至今，成為傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)方法，可以準(zhǔn)確檢出自然流產(chǎn)物或胎兒染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的異常，是檢測自然流產(chǎn)組織染色體核型異常或產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。該方法技術(shù)穩(wěn)定、質(zhì)量可靠，能提供染色體改變的完整圖，其費(fèi)用低，臨床應(yīng)用廣泛。同樣，該技術(shù)需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，耗時長，微小的染色體畸變(＜5Mb)不易檢出，成功率直接受制于絨毛組織的新鮮程度和絨毛的形態(tài)［5］。胚胎停止發(fā)育時，絨毛生長受到影響，停止發(fā)育時間越長，組織越不新鮮，形態(tài)就越差，細(xì)胞培養(yǎng)成功率就越低。本研究中正常組絨毛組織全部為新鮮絨毛組織，30例標(biāo)本絨毛染色體培養(yǎng)全部成功，而其他3組的絨毛標(biāo)本，選擇外觀相對新鮮，形態(tài)較好的絨毛標(biāo)本進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)G顯帶分析48例，培養(yǎng)成功43例，成功率達(dá)89.58%。

FISH利用熒光標(biāo)記的DNA探針與被檢測樣本中DNA堿基對的互補(bǔ)性，在探針與樣本DNA雜交后，通過熒光顯微鏡檢測熒光信號發(fā)現(xiàn)細(xì)胞、組織樣本中的染色體或基因異常。可以檢測細(xì)胞間期的染色體，不需要細(xì)胞培養(yǎng)，在48h內(nèi)得到結(jié)果，明顯減輕患者等待結(jié)果過程的焦慮情緒。結(jié)果判讀簡單，精確度高，靈敏性好，特異性強(qiáng)，可檢測平衡易位，準(zhǔn)確檢測3Mb大小的結(jié)構(gòu)異常，用于羊水間期細(xì)胞產(chǎn)前診斷非整倍體的檢測與核型分析的準(zhǔn)確率幾乎一致［6］。本研究選取了13/21、16/22、18/X/Y3組探針對9例相對不太新鮮，形態(tài)稍差絨毛組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)G顯帶分析技術(shù)和FISH檢測。其中5例細(xì)胞培養(yǎng)G顯帶分析技術(shù)檢測失敗，其余4例與FISH檢測結(jié)果一致，9例FISH檢測全部成功。3例絨毛組織中檢測到了FISH異常信號，分別為三倍體、21－三體、18－三體。高通量全基因組DNA測序技術(shù)以能1次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測定等為標(biāo)志。不需要培養(yǎng)，操作簡單，分析周期短，特異性強(qiáng)，分辨率高，覆蓋整個基因組，最小可以檢測到10Kb的微小片段異常。目前應(yīng)用較多的是目標(biāo)基因組區(qū)域測序，絨毛樣本染色體檢測方面，僅用于染色體非整倍體的快速檢測。目前進(jìn)行全基因組染色體檢測報道較少。它費(fèi)用較高，并且不能發(fā)現(xiàn)染色體平衡易位、倒位或點(diǎn)突變及染色體整倍體。因此，還不適合作為常規(guī)檢測方法，但可作為常規(guī)染色體核型分析的補(bǔ)充檢測手段［7－8］。本研究選取了65例胚胎停止發(fā)育時間長，絨毛組織陳舊、形態(tài)極差樣本進(jìn)行高通量全基因組DNA測序技術(shù)檢測染色體，檢測成功率達(dá)100%，發(fā)現(xiàn)26例異常。綜合以上，不難發(fā)現(xiàn)，臨床醫(yī)務(wù)工作者對于流產(chǎn)患者，首選絨毛染色體細(xì)胞培養(yǎng)G顯帶分析技術(shù);其他技術(shù)如FISH、高通量全基因組DNA測序技術(shù)等可以作為絨毛染色體細(xì)胞培養(yǎng)G顯帶分析技術(shù)的補(bǔ)充和完善。所以，應(yīng)根據(jù)胚胎停止發(fā)育時間、絨毛組織新鮮程度、患者流產(chǎn)次數(shù)和經(jīng)濟(jì)狀況、對胚胎停止發(fā)育流產(chǎn)原因追查的迫切情況等幫助患者分析，選擇合適的染色體檢測方法。

本研究采用3種絨毛染色體檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)149例樣本中共有55例染色體異常核型，異常核型中三體綜合征占65.45%，以5－三體、16－三體、22－三體多見，Turner綜合征占12.73%，結(jié)構(gòu)異常占10.91%。與文獻(xiàn)報道的通過多種方法檢測自然流產(chǎn)絨毛組織染色體發(fā)現(xiàn)50%～70%存在核型異常，而結(jié)構(gòu)異常比較少見，僅占6%基本一致［9］，明顯低于86%的異常率［10］。現(xiàn)已證實染色體數(shù)目異常發(fā)生的主要原因是在發(fā)生減數(shù)分裂的配子中或早期卵裂的受精卵中出現(xiàn)了染色體異常的分離和復(fù)制［11］。從4組染色體情況來看，正常發(fā)育胚胎染色體異常率很低;發(fā)生1次自然流產(chǎn)和2次自然流產(chǎn)的染色體異常率沒有明顯差別，約44.44%～57.50%;而3次或3次以上復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的染色體異常率反而較1次或2次流產(chǎn)的低，提示隨著流產(chǎn)次數(shù)的增加，存在著更多其他方面導(dǎo)致流產(chǎn)的原因。

作者：李亞麗 余小平 王方娜 高健 楚偉 李娟 霍平 王超 單位：河北省人民醫(yī)院