卵巢癌診斷和治療分析范文

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《腫瘤防治研究雜志》2015年第十二期

摘要：

聚酰胺-胺樹狀大分子（polyamidoaminedendrimer,PAMAMD）因具有高度枝化、結(jié)構(gòu)可控、單分散性等特點，已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。靶向分子修飾后的PAMAMD可作為各種客體分子的靶向載體，顯著提高客體分子的生物相容性、分散穩(wěn)定性和靶向性，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于癌癥成像診斷和靶向治療研究。本文介紹了PAMAMD靶向系統(tǒng)特點，并綜述了近年來該系統(tǒng)在卵巢癌診斷和治療中的應(yīng)用，包括在循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulationtumorcells,CTCs）捕獲、卵巢癌成像診斷和靶向治療中的應(yīng)用，最后討論了該系統(tǒng)在卵巢癌研究中所面臨的挑戰(zhàn)及應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：

卵巢癌；聚酰胺-胺樹狀大分子；靶向系統(tǒng)；診斷；治療

卵巢癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，由于缺乏特異性的臨床癥狀和敏感的生物學(xué)標(biāo)志物，60%卵巢癌患者被發(fā)現(xiàn)時已是晚期（Ⅲ~Ⅳ期），且大多數(shù)卵巢癌患者在治療過程中可能出現(xiàn)化療耐藥，是目前病死率最高的婦科惡性腫瘤[1-2]。因此尋找更有效的卵巢癌篩查和早期診斷方法以及特異性治療方案，對提高治愈率和降低死亡率尤為重要。靶向分子修飾后的聚酰胺-胺樹狀大分子（polyamidoaminedendrimer,PAMAMD）可作為各種靶向系統(tǒng)載體：當(dāng)其作為磁分離載體，能快速捕獲并分離CTCs，為卵巢癌早期診斷提供技術(shù)手段；作為造影劑載體，能提高各種成像技術(shù)的對比度和敏感度，利于卵巢腫瘤準(zhǔn)確定位及定性；作為藥物或治療基因載體，提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物或治療基因濃度，實現(xiàn)卵巢癌靶向治療。此外，PAMAMD為載體的靶向系統(tǒng)同時兼具良好的生物相容性、穩(wěn)定性和低毒性等特點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于卵巢癌基礎(chǔ)研究。

1PAMAMD靶向系統(tǒng)的特點

PAMAMD是一類由中心向外對稱發(fā)散而高度枝化的新型納米大分子化合物，可通過迭代的Michael加成和酰胺化反應(yīng)合成不同代數(shù)（G0-G10）[3-4]。PAMAMD不僅可利用豐富的表面官能團(tuán)連接多種具有特異性的靶向分子，而且可通過內(nèi)部空腔的包裹作用或表面官能團(tuán)的化學(xué)偶聯(lián)作用結(jié)合磁性粒子[5]、小分子藥物[6]、造影劑[7-8]或者治療基因[9-10]等客體分子，通過增加客體分子的生物利用度及選擇性作用于腫瘤細(xì)胞可提高藥物功效、增加圖像分辨率和減少傳統(tǒng)化學(xué)治療的毒性。目前，有研究表明PAMAMD靶向系統(tǒng)可用于卵巢癌早期診斷[5]，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)能增加化療藥物對耐藥卵巢癌細(xì)胞的毒性，為耐藥卵巢癌患者的治療帶來曙光[6,11]。

2PAMAMD靶向系統(tǒng)在CTCs捕獲中的應(yīng)用

外周血CTCs的檢測有助于卵巢癌的早期診斷、判斷預(yù)后、評估抗腫瘤藥效及制定個體化治療方案，是一種具有高度可行性和可重復(fù)性的非侵入性診斷手段[12]。免疫磁性分離技術(shù)是目前最常用的CTCs分離和富集技術(shù)，該方法可實現(xiàn)全血中高效率和高選擇性捕獲CTCs，然而，由于該方法需要長達(dá)1h的靜態(tài)反應(yīng)條件而常常受限于各個領(lǐng)域。Banerjee等[5]借助超支化G4PAMAMD表面64個伯氨鍵能同時連接多個官能團(tuán)的能力，以Cy5為顯像劑分子、轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferring,Tf）為靶向分子及磁珠（MNPs）為磁分離分子，形成MDNS復(fù)合物，該復(fù)合物能迅速捕獲（5min）轉(zhuǎn)鐵蛋白受體表達(dá)陽性（TfR+）的腫瘤細(xì)胞，即使腫瘤細(xì)胞的濃度低至0.001%，其捕獲效率仍可高達(dá)80%。PAMAMD因獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)，使以其為載體的靶向系統(tǒng)具有良好的靶向性及分散性，可快速和特異性捕獲CTCs，有望成為臨床顯著檢測CTCs的一種新方法。

3PAMAMD靶向系統(tǒng)在卵巢癌成像中的應(yīng)用

影像學(xué)檢查，如經(jīng)陰道超聲、計算機(jī)X線斷層掃描成像（computedtomography,CT）、磁共振成像（magneticresonanceimaging,MRI）、正電子發(fā)射斷層顯像（positronemissiontomography,PET）等在卵巢腫瘤的定位及定性中發(fā)揮重要作用，成像對比度和敏感度的高低直接影響卵巢癌的早期診斷、分期及手術(shù)和化療方案的選擇[13]。隨著醫(yī)療水平的不斷提高，傳統(tǒng)小分子造影劑開始暴露其不足之處，如半衰期短、特異性差、用途單一及肝腎毒性等。PAMAMD靶向系統(tǒng)適用于多種成像技術(shù)，如光學(xué)成像（opticalimaging,OI）、CT、MRI和雙模態(tài)成像等，歸因于其可同時結(jié)合靶向分子和大量造影劑，使造影劑特異性地在腫瘤部位富集，提高對腫瘤組織的成像對比度和靈敏度，加快顯像時間，并減少肝腎毒性。

3.1光學(xué)成像光學(xué)成像在腫瘤研究中扮演重要角色，然而腫瘤靶向特異性光學(xué)探針的設(shè)計是當(dāng)今該技術(shù)研究領(lǐng)域的難點。Modi等[14]用熒光素（FITC）標(biāo)記的PAMAMD偶聯(lián)卵泡刺激素肽（FSH33）合成靶向光學(xué)分子探針，對卵巢癌細(xì)胞及裸鼠移植瘤模型進(jìn)行光學(xué)成像，發(fā)現(xiàn)該探針可以與卵巢癌細(xì)胞表面的卵泡刺激素受體（FSHR）特異性結(jié)合而用于卵巢癌的靶向診斷。Zhu等[15]將熒光標(biāo)記的PEG化PAMAMD注射至荷卵巢癌裸鼠體內(nèi)，由于PEG的修飾，該系統(tǒng)具有高效的腫瘤被動靶向能力，注射1h后腫瘤組織能從正常組織背景中區(qū)分出來，24h熒光信號達(dá)到高峰，48h后才有輕微衰減，且PEG化程度越高，熒光信號越強(qiáng)。以PAMAMD為載體的靶向光學(xué)成像探針可在腫瘤部位聚集，具有很強(qiáng)的熒光信號，為實時動態(tài)監(jiān)測細(xì)胞及腫瘤提供強(qiáng)有力的實驗手段，有望用于手術(shù)實時成像。

3.2計算機(jī)X線斷層掃描成像利用PAMAMD獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)和其表面的易修飾性，可以制備多功能化的納米顆粒，以滿足特定的應(yīng)用需求。國內(nèi)彭琛等[16]以表面修飾葉酸（fo-licacid,FA）的PAMAMD為模板，加入金鹽，利用PAMAMD內(nèi)部空腔截留合成的金納米粒子，制備得到多功能化的靶向CT造影劑。在此基礎(chǔ)上該研究者[17]，將金納米粒子（AuNPs）和含碘（I）造影劑泛影酸（DTA）同時與FA修飾的PAMAMD結(jié)合，合成雙元素協(xié)同CT造影劑。相較于單一的含Au或I造影劑，該造影劑具有更高的X-射線衰減系數(shù)和CT信號強(qiáng)度。該研究者制備的以上兩種造影劑均顯示出良好的體外癌細(xì)胞及體內(nèi)腫瘤模型靶向性能和X-射線衰減性能，并且可作為探針，用于過表達(dá)葉酸受體（folatereceptor,FR）腫瘤的靶向CT成像。

3.3磁共振成像磁共振成像是臨床上常用的無侵入性腫瘤診斷技術(shù)，通常需要借助造影劑對腫瘤進(jìn)行早期診斷。與小分子造影劑相比，大分子MRI造影劑具有成像對比度強(qiáng)、敏感度高和診斷成像時間長等優(yōu)點，現(xiàn)已受到研究者們的廣泛關(guān)注。早在1997年，Wiener等[18]在靶向分子FA修飾的PAMAMD表面偶聯(lián)T1MRI造影劑釓，合成大分子靶向MRI造影劑。該造影劑具有合適的r1弛豫率，且對過表達(dá)FR的卵巢癌細(xì)胞具有較好的靶向特異性。隨后研究者[7]將該靶向MRI造影劑注入荷卵巢癌裸鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)FR表達(dá)陽性的卵巢癌MRI信號顯著增強(qiáng)，且與單用非特異性的釓特醇（Gd-HP-DO3A）造影劑相比，對比度增強(qiáng)33%。在此基礎(chǔ)上，Ye等[19]將FA通過PEG共價偶聯(lián)至PAMAMD，再修飾Gd-DTPA，合成可降解的、具有腫瘤靶向性的樹枝狀造影劑FA-PEG-G2-DTPA-Gd。與醫(yī)用造影劑馬根維顯相比較，該大分子造影劑具有較高的弛豫率（r1=17.1mM−1s−1），聚乙二醇的引入進(jìn)一步提高其生物相容性和血液循環(huán)時間，降低免疫原性和Gd3+滯留，且以FA為靶向分子后表現(xiàn)更好的腫瘤靶向性，是一種潛在的腫瘤靶向成像用MRI造影劑，特別適用于腫瘤早期診斷。

3.4雙模態(tài)成像PAMAMD通過將兩種不同的分子影像探針“合二為一”，使其能同時用于兩種分子影像技術(shù)成像，不僅克服了單一分子影像技術(shù)的應(yīng)用局限，而且使不同分子影像技術(shù)的優(yōu)勢疊加，為卵巢癌的早期診斷和轉(zhuǎn)移病灶的發(fā)現(xiàn)提供可能。光學(xué)成像分辨力低、穿透力弱，與PET連用能夠評價腫瘤形態(tài)及微環(huán)境變化，為臨床腫瘤的診斷與治療提供重要依據(jù)。臨床研究表明，HER2在卵巢癌中高表達(dá)，Wang等[8]將PAMAMD作一個平臺，以anti-HER2親和體分子ZHER2:342為靶向分子、近紅外熒光（NIRF）CY5.5為光學(xué)成像分子、64Cu-DOTA為PET成像分子組裝靶向雙模態(tài)成像探針（簡稱64Cu-DPCZ），用該探針對SKOV3細(xì)胞進(jìn)行熒光染色，在細(xì)胞膜和胞內(nèi)區(qū)均觀察到強(qiáng)熒光信號。隨后將該探針經(jīng)尾靜脈注入荷卵巢癌的裸鼠體內(nèi)，1h后，無論是NIRF成像還是PET成像都可對異體移植瘤清晰顯影，且γ射線對組織的穿透能力強(qiáng)，基本不受組織深度的影響，可應(yīng)用于盆腔深部卵巢癌的成像。鑒于CT對于實性組織比較敏感，而MRI具有優(yōu)良的軟組織對比及功能成像特性，CT和MRI的聯(lián)合應(yīng)用能夠提供病灶部位的高空間分辨率和時間分辨率。Chen等[20]以葉酸為靶向分子、樹狀大分子為載體合成納米金顆粒，并螯合Gd3+形成CT/MR雙模態(tài)成像造影劑，通過分析表明PAMAMD上螯合28個Gd3+，包裹193個金原子。FR表達(dá)陽性的荷瘤裸鼠實驗結(jié)果表明在每個時間點，不論是CT值還是MR信號強(qiáng)度，該靶向探針比無葉酸修飾的非靶向探針高得多，且在腫瘤組織中造影劑的保留時間更長。靶向探針顯示出了作為MR成像方式的弛豫效能和作為CT成像方式的X射線衰減特性，能夠用于FR表達(dá)陽性腫瘤的CT/MR靶向雙模成像，且具有較長的血液循環(huán)時間，有望應(yīng)用于卵巢癌靶向成像領(lǐng)域。

4樹狀大分子靶向系統(tǒng)在卵巢癌治療中的應(yīng)用

靶向分子修飾的PAMAMD作為藥物或治療基因的靶向給藥載體，可以特異性地結(jié)合到腫瘤細(xì)胞表面，并可以被細(xì)胞內(nèi)化，從而實現(xiàn)靶向治療，提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物或治療基因濃度，增加藥效和降低毒副作用，現(xiàn)已成為癌癥治療領(lǐng)域研究的重點課題。

4.1化學(xué)治療大多數(shù)卵巢癌患者原發(fā)性或治療過程中出現(xiàn)化療耐藥，成為卵巢癌治療失敗和復(fù)發(fā)的最主要原因之一。目前認(rèn)為任何能提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥物有效濃度的方法都是克服耐藥的可行方法。Yellepeddi等[6]將生物素化的PAMAMD作為順鉑的靶向給藥載體，體外研究發(fā)現(xiàn)，該靶向給藥系統(tǒng)對四種卵巢癌細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度（IC50）顯著低于游離順鉑，且即使是耐順鉑細(xì)胞株，經(jīng)該靶向系統(tǒng)介導(dǎo)的順鉑攝取量，明顯高于游離順鉑的攝取量。體內(nèi)研究結(jié)果表明，該靶向系統(tǒng)與游離順鉑相比，可在使用低劑量順鉑時達(dá)到有效的抗腫瘤濃度，成功降低了順鉑的劑量依賴性毒性作用。Yabbarov等[11]將阿霉素（DOX）用酸敏感的順式烏頭酸酐（CA）共價連接到重組甲胎蛋白D3結(jié)構(gòu)域（rAFP3D）修飾的PAMAMD上，體外研究發(fā)現(xiàn)，DOX敏感的卵巢癌SKOV3細(xì)胞和DOX耐藥的SKVLB細(xì)胞對經(jīng)該靶向給藥系統(tǒng)介導(dǎo)的DOX攝取量比游離DOX的攝取量高5倍。研究還發(fā)現(xiàn)該靶向給藥系統(tǒng)對SKVLB細(xì)胞IC50為0.53μМ，是游離DOX的1/24，且該復(fù)合物在中性條件下穩(wěn)定，而酸性環(huán)境下釋放出DOX進(jìn)入細(xì)胞核，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗腫瘤活性，可應(yīng)用于耐藥卵巢癌的治療，為耐藥卵巢癌的治療提供新思路。

4.2基因治療研究發(fā)現(xiàn)小干擾RNA（siRNA）可在mRNA水平上敲除目的基因的表達(dá)，成為卵巢癌個體化基因治療研究的新方向[21]。由于siRNA容易被內(nèi)源性RNA酶降解，且因帶大量負(fù)電荷不能自由地穿過細(xì)胞膜及核膜，因此，尋找合適的基因載體成為基因治療是否能在臨床上應(yīng)用的關(guān)鍵所在。Patil等[9]將PAMAMD作為一種新型納米級基因載體，通過表面正電荷與BCL-2siRNA主鏈上帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)靜電結(jié)合形成高度穩(wěn)定的復(fù)合物，該復(fù)合物可保護(hù)siRNA避免RNA酶的降解，經(jīng)靶向分子促黃體激素釋放激素肽（LHRH）修飾后，將BCL-2siRNA輸送到過表達(dá)促黃體激素釋放激素受體（LHRHR）的卵巢癌A2780細(xì)胞內(nèi)。RT-PCR結(jié)果顯示靶向組顯著抑制BCL-2基因表達(dá)，抑制率明顯高于非靶向組。Kala等[21]利用PAMAMD這個基因載體，將PI3K/AKT信號通路上AKTsiRNA轉(zhuǎn)染至卵巢癌SKOV3細(xì)胞內(nèi)，不論是在體外細(xì)胞實驗，還是在體內(nèi)卵巢癌模型中，該復(fù)合物表現(xiàn)出良好的腫瘤抑制作用，且第一次報道該復(fù)合物聯(lián)合紫杉醇比單用紫杉醇或PAMAMD-AktsiRNA的腫瘤抑制作用更強(qiáng)，為卵巢癌基因治療和化學(xué)治療聯(lián)合藥物的開發(fā)提供參考。

5結(jié)語與展望

由于靶向分子修飾的PAMAMD具有出色的腫瘤細(xì)胞靶向性和多功能性，已在卵巢癌研究中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。但目前絕大部分PAMAMD靶向系統(tǒng)仍處于實驗室研究階段，因為該系統(tǒng)還存在一些待解決的問題，如溶血效應(yīng)、長期生物毒性、體內(nèi)蓄積性和生產(chǎn)成本高等[22]。設(shè)計并制造出低毒、低成本且聯(lián)合診斷、影像學(xué)和靶向治療為一體的新型PAMAMD靶向系統(tǒng)，是最具挑戰(zhàn)性的重要課題之一。除了PAMAMD自身合成技術(shù)需要不斷完善，PAMAMD表面修飾的改進(jìn)也是未來研究的重點。相信經(jīng)過研究者們的不斷努力，以PAMAMD為載體的靶向系統(tǒng)將為卵巢癌的早期診斷、個性化的治療開辟新的思路，使得其早日安全有效地應(yīng)用于臨床。

作者：孫平風(fēng) 聶麗菊 葉稱連 鄭鳳霞 傅芬 許恒毅 單位：南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室