中藥注射劑過敏類反應研究思路范文
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中藥注射劑(traditionalchinesemedicineinjection，TCMI)引發的藥物不良反應是限制其使用的重要因素，據統計，被列入中國國家基本藥物目錄(2004版)中的33種TCMI均有臨床不良反應事件發生，其中過敏反應占75%，具體表現為皮膚瘙癢，各種過敏性皮疹，粘膜水腫等，且具有不良反應發生時間較早，累及多器官，涉及多品種的特點［1］。由于其臨床表現符合Ⅰ型超敏反應的主要特點，早期多認為TCMI所引發的過敏反應屬于Ⅰ型超敏反應，所以在探索過敏原或建立檢測模型的過程中，多使用以Ⅰ型超敏反應機制為基礎的實驗模型。例如，我國《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》中對TCMI過敏反應的檢測要求為，全身主動過敏試驗(activesystemicanaphylaxis，ASA)和皮膚被動過敏試驗(passivecutaneousanaphylaxis，PCA)，這2種實驗均是以Ⅰ型超敏反應的相關機制為基礎［2］。而后續有研究發現，在TCMI的動物實驗中，雙黃連注射液及魚腥草注射液等被認為首次給藥就容易出現臨床過敏反應的注射劑，能夠引發動物的類過敏反應，因此認為，TCMI引發的不良反應類型實際上為類過敏反應(anaphylactoidreaction)［3-4］。同樣，對青霉素引發臨床過敏反應的研究也是如此。早期認為青霉素引發的過敏類反應屬于典型的Ⅰ型超敏反應，但后續研究發現，僅不到10%被確診為真正的過敏反應，許多聲稱對青霉素過敏的人，并沒有在體內檢測到IgE抗體，同時皮試結果為陰性。有研究發現，某些β內酰胺引起的過敏反應并不是傳統意義上的免疫學反應，而是一種劑量依賴的反應，通過非免疫學的途徑同樣能夠引起組胺等其他炎癥物質的釋放從而引發相關反應，這種反應即為類過敏反應［5-7］。基于上述相關研究，本文介紹了I型超敏反應和類過敏的一般原理、及目前研究常用的實驗方法，同時總結了3種臨床報道較多的，TCMI的過敏類反應的研究進展，希望能為TCMI過敏類反應的全面性提供參考。
1超敏反應
1.1超敏反應的一般原理
藥物過敏反應按照其發生機制可以分為4類，包括:Ⅰ型/速發型超敏反應，主要由藥物特異性IgE抗體所介導;Ⅱ型/溶細胞或細胞毒性超敏反應，由藥物特異性IgG抗體或IgM抗體介導;Ⅲ型/免疫復合物型，同樣由藥物特異性IgG抗體或IgM抗體介導;Ⅳ型/遲發型，由藥物特異性T細胞介導［8］。藥物過敏反應的另一分類方式由Levine于1996年提出的，基于給藥時刻和癥狀產生時刻的間隔時間的長短來分類，包括速發型、加速型和遲發型3類。這一分類方式隨后被簡化為速發型(間隔時間≤1h)和非速發型(間隔時間＞1h)2類［9］。以上這2種分類方式也常聯合使用，一般認為Ⅰ型速發型超敏反應即速發型是由IgE介導的，其余3類反應則屬于非速發型反應。根據上文提到TCMI過敏反應發生時間較短的特點，此處主要討論Ⅰ型超敏反應。Ⅰ型超敏反應的一般機制包括致敏和激發效應2部分內容。在致敏階段，IgE的產生決定著Ⅰ型超敏反應的發生和發展。致敏階段的初期，B細胞中發生偏向IgE的類別轉換是IgE水平增加的直接原因。這一過程受樹突狀細胞(DC)和T細胞的共同調節，其中Th2細胞發揮主要作用，整體表現為變應原特異性Th1和Th2細胞平衡失調。DC作為抗原提呈細胞首先和IgE特異性的變應原結合，將其抗原決定簇提呈給T細胞，特異性CD4+T細胞隨之而產生的刺激導致T細胞產生并釋放白介素-4(IL-4)，以及T細胞表面CD40配體表達水平的上調(CD40L)。變應原特異性B細胞上CD40的激活，導致其表面共刺激分子CD80和CD86表達水平上調，從而使更多效應T細胞表達CD40L同時通過IL-4誘導增強對B細胞的刺激。CD40介導的對B細胞的刺激與IL-4受體信號協同，增加Cε基因轉錄同時激活誘導胞嘧啶核苷脫氨酶，使IgE基因組位點發生重排并產生IgE抗體。該類IgE抗體具有嗜細胞性，迅速通過肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面高親和性的IgEFc段受體{(FCεRⅠ)}與之結合，在變應原和效應細胞間建立功能聯系。當機體再次接觸變應原，變應原特異性識別肥大細胞/嗜堿性粒細胞表面IgE抗體，與之結合，引發細胞脫顆粒反應，釋放組胺、緩激肽等儲備介質和白三烯(LTs)、前列腺素D2(PGD2)、血小板活化因子(PAF)等新合成的物質，引發機體平滑肌收縮，毛細血管擴張，通透性增加，腺體分泌增加，從而在不同水平不同部位引發不良反應，包括全身性的過敏休克、呼吸系統相關的過敏性哮喘和鼻炎、消化系統相關的過敏性胃腸炎及皮疹等［10-11］。Ⅰ型超敏反應發生的機制提示在研究TCMI所致過敏反應機制及確證過敏原時，可關注的階段包括:(1)致敏階段，Th2細胞、抗原提呈細胞(主要為DC)及B細胞表面與B細胞發生偏向IgE類別轉化的細胞標志物水平的變化，及相關細胞因子水平，代表有CD40L、CD40和IL-4;(2)抗原特異性IgE抗體水平及血清總IgE抗體水平;(3)及激發后肥大細胞或嗜堿性粒細胞脫顆粒所釋放的活性物質的濃度變化。
1.2研究Ⅰ型超敏反應常用實驗技術
現有常用于研究TCMI過敏原的實驗模型包括:《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》中收錄的豚鼠的全身主動過敏模型、大鼠、小鼠或豚鼠被動皮膚過敏試驗動物模型，以及大鼠嗜堿性白血病細胞(RBL-2H3)模型［2-12］。研究Ⅰ型超敏反應時常用的觀察、檢測指標包括:(1)全身主動過敏試驗模型中，動物行為學的改變，如:按照過敏反應癥狀評價標準評價動物是否出現過敏反應及反應程度［9］;(2)病理切片觀察，如注射用雙黃連與生脈注射液對Hartley豚鼠與BN大鼠ASA影響的研究中，在激發后將動物處死，蘇木素－伊紅(HE)染色觀察肺組織是否出現淋巴細胞浸潤等炎癥病理表現［13］;(3)IgE抗體檢測:IgE抗體作為參與Ⅰ型超敏反應的代表性抗體，其血清水平的檢測也是Ⅰ型超敏反應研究過程中的關鍵內容。現多選用ELISA試劑盒對其含量進行測定［14-15］。RBL-2H3細胞是由Leonard等［16］在1973年從Wistar大鼠中首次分離得到的嗜堿性白血病細胞株，應用于體外特異性抗體IgE與細胞表面的高親和力FcεRI受體結合后下游事件研究，其胞質內含有豐富的嗜堿性顆粒，當被激活時，可釋放組胺、β-氨基己糖苷酶和類胰蛋白酶等物質［17］。
2類過敏反應
2.1類過敏反應的一般原理
對藥物超敏反應深入研究發現許多臨床所使用的藥物在進入人體后，無潛伏期，也無變應原特異性IgE抗體的產生，且無抗原與抗體特異性結合的過程，迅速引發與Ⅰ型超敏反應相同的臨床表現，Dukor［18］將之稱為類過敏反應。這類反應和Ⅰ型超敏反應的臨床表現完全相同，最大的區別就是血清中檢測不到變應原特異性的IgE抗體［19］。現在研究認為類過敏反應的機制主要包括2類［20］，一是變應原直接刺激嗜堿性粒細胞或肥大細胞釋放生物活性介質，該過程基本符合Ⅰ型超敏反應激發效應階段的相關機制;二是變應原通過激活補體系統間接刺激嗜堿性粒細胞或肥大細胞釋放生物活性介質。補體活化包括經典途徑、甘露糖結合凝集素途徑和旁路途徑3個主要途徑［21-22］。類過敏反應的發生主要與激活旁路途徑相關。變應原作為一種外源性的異物顆粒與血清中自發產生的C3b結合，并隨后與單鏈B因子在D因子的作用下，將B因子裂解為Ba和Bb，Bb與C3b結合形成C3bB的復合物，并與P因子結合形成C3bBP復合物，即C3轉化酶，該復合物能夠再次作用于C3將其水解為更多的C3a和C3b，多個C3b沉積于顆粒表面，形成C3bBb3b復合物，即旁路途徑的C5轉化酶，從而裂解C5產生C5a和C5b。而產生C3a、C5a可與其MC/BAS表面受體結合進而導致MC脫顆粒而產生速發型變態反應癥狀。類過敏反應發生的機制提示在研究TCMI所致類過敏反應機制及確證變應原時，關注的問題包括(1)激發后肥大細胞脫顆粒所釋放的活性物質的濃度變化;(2)補體水平的測定;(3)血清IgE抗體測定，該指標的測定主要是為了與Ⅰ型超敏反應進行區分。
2.2研究類過敏反應常用實驗技術
現有研究常用TCMI類過敏反應的實驗模型包括:肥大細胞脫顆粒模型(RBL-2H3與P815細胞系、體外模型)、Beagle犬類過敏模型(動物模型)、以及與皮膚血管滲透性改變相關的類過敏模型(動物模型)，如，對試驗動物一次性靜脈注射含0.4%伊文思藍(EB)的相應受試物，隨后記錄各組動物耳廓藍染數，進行耳廓藍染程度評分［23］。同樣，P815細胞作為一種細胞模型，也常常用于類過敏實驗的體外研究［24］。研究Ⅰ型超敏反應時常用的觀察、檢測指標包括:(1)利用動物模型進行試驗時，類似于Ⅰ型超敏反應，通過最終觀察動物行為學的改變，如:按照類過敏反應癥狀評價標準評價動物是否出現過敏反應及反應程度［25］;(2)在與皮膚血管滲透性改變相關的類過敏模型中，通過最終觀察記錄，比較血管滲透性改變的程度，來確定動物發生類過敏反應的情況［25-26］;(3)實驗動物一次靜脈注射測試藥物，ELISA檢測給藥后血液中類過敏反應特征細胞因子，包括組胺、類胰蛋白酶水平和補體各項指標等［25-27］。P815細胞來源于小鼠的肥大細胞系，具有肥大細胞的生物學特性，許多研究表明P815可被C48/80激活發生脫顆粒，并釋放組胺、白介素和前列腺素等物質，被廣泛的應用于篩查變應原和免疫毒性機制研究［28］。類過敏反應的最終臨床表現和Ⅰ型超敏反應相同，均是由肥大細胞脫顆粒釋放組胺等炎癥因子在不同組織器官所引起的不良反應，故其在動物模型中所引發的行為學改變應是一致的，包括在病理切片中所顯示出的改變也應基本一致。二者主要的區別體現在Ⅰ型超敏反應致敏后體內IgE水平的升高，而類過敏反應中則不存在此過程。
3中藥注射劑過敏類反應機制的研究進展
根據國家藥品不良反應監測年度報告(2016年)顯示，2016年藥品不良反應/事件報告中，涉及懷疑藥品150.7萬例次，中藥占16.6%，其中按藥品給藥途徑分布，靜脈注射給藥占53.2%，其他注射給藥占0.6%，口服給藥占40.2%，其他給藥途徑占6.0%，與2015年相比，總體給藥途徑分布無明顯變化。且從報告涉及劑型與給藥途徑看，TCMI占比較高，從藥品類別上看，主要涉及活血化瘀類、清熱解毒類、益氣養陰類和涼開類TCMI［29-30］。雙黃連注射劑、清開靈注射劑和魚腥草注射液作為其中最常見引發過敏反應，也是其中被研究最多的幾種注射劑［31］。而吐溫－80作為TCMI中常見的助溶劑，也有大量報道證明其是引起TCMI過敏類反應的重要因素。
3.1關于綠原酸致敏性的相關研究
上述3種常見的中藥注射劑均屬于清熱解毒類，臨床應用率較高，同時發現其均含有綠原酸(Chlorogenicacid，CA)。CA廣泛存在于多種TCMI，近幾年對其致敏性的研究日益增多，其是否有致敏性問題引起爭論。早在10世紀60年代，Freedman與Layton研究小組分別對CA的致敏性研究發表了一系列文章，持相反觀點并展開了激烈爭論。Freedman和Bariana等［32-33］發現綠咖啡豆的水提取液高度致敏，通過對組分分析發現CA可能是主要過敏原，通過進一步研究，推測CA作為半抗原與人體內蛋白質結合而產生致敏活性。另一方面，Layton等［34］通過純化手段，臨床實驗及動物實驗發現CA不是過敏原，而是其粗提取物中的大分子物質。國內的研究主要關注與TCMI中CA的潛在致敏性，吳曉冬等［35］采用ACA和PCA對不同純度的CA提取物致敏試驗發現，CA沒有致敏原性，而低純度提取物中存在的大分子物質與致敏反應密切相關。而何洲等［36］在體外將CA與牛血清蛋白合成人工抗原免疫昆明小鼠，CA抗體IgG檢測呈陽性，ACA試驗中小鼠均出現不同程度的過敏反應，認為CA可以作為一種半抗原刺激小鼠產生免疫應答并引發過敏反應。對于TCMI中CA是否是過敏原仍存在爭議，需采用敏感有效的體內外模型進行深入的探究。
3.2關于吐溫80致敏性的相關研究
近年來，針對TCMI過敏機制的各種試驗研究模型和方法，主要被分成了2大類，前期如同上述對CA的研究，主要以過敏反應的一般原理為依據，采用多次致敏的試驗技術，而隨后，由于一些物質在一型超敏反應的模型中并未出現陽性反應，但在臨床應用中卻出現類似一型超敏反應的癥狀，且隨著免疫學的進一步發展，有研究開始以類過敏反應的一般原理為依據，采用單次給藥手段進行研究。孫偉偉等［37］在研究吐溫80及其配置的魚腥草注射液的過敏反應試驗中豚鼠過敏反應模型多次給藥的方式，評價藥物對豚鼠的敏感性，并得到了豚鼠血漿IgE水平升高，動物出現典型過敏反應的陽性結果。而在羅霞等［38］人以典型類過敏反應研究細胞RBL-2H3對吐溫-80與過敏反應關系得到，也吐溫-80可引起RBL-2H3細胞脫顆粒釋放炎癥介質存在劑量關系的陽性結果;且劉婷等［3］采用Beagle犬類過敏反應模型評價吐溫-80及其配置的魚腥草注射液時，也得到了明顯的陽性結果，該研究還發現吐溫-80的致敏反應與補體激活有關。
3.3關于雙黃連注射液致敏性的相關研究
另外，對雙黃連注射劑所引發的過敏反應則集中在類過敏反應中，易艷等［39］通過小鼠耳廓藍染實驗證明雙黃連注射液在在臨床等效將和2倍劑量小有明顯增高細血管通透性的作用，即存在致類過敏反應的作用;程芳等［26］人在對注射用雙黃連的研究中發現，其導致的急性過敏反應可能主要為類過敏反應，其主要發生機制可能為通過釋放組胺和類胰蛋白酶等生物活性介質導致機體多系統產生毒性反應，且雙黃連本身也可能含有具有類組胺效應的成分，在血壓下降等癥狀的產生過程中發揮作用;該研究同時采用Wistar大鼠多次致敏模型對其進行評價時得到陰性結果，且血清IgE水平與生理鹽水對照組比較差異無統計學意義，提示雙黃連注射液所產生的過類性反應可能單純是類過敏反應。而從上述關于魚腥草注射液及吐溫-80的研究結果中可以看出，該類制劑所引發的過敏類反應的機理可能同時包括類過敏和Ⅰ型超敏反應。上述內容提示，在對TCMI進行安全性評價時，不能僅考慮其可能引發Ⅰ型超敏反應，同時也要關注其引發其他超敏反應的可能性。另外，雖然TCMI出現多品種多發過敏性不良反應的情況，但就其過敏反應的機制及過敏原物質基礎的研究，卻相對較少深入展開，現有的主要研究均集中在上述品種。
4總結
基于TCMI引發過敏反應的一般臨床癥狀及特點，目前普遍認為其反應類型屬于Ⅰ型超敏反應，近年來，有研究提出其發生機制可能符合類過敏反應一般規律。通過研究Ⅰ型超敏反應及類過敏反應的基本的機制，可以發現，二者最明顯的區別就是血清IgE水平和抗原特異性IgE水平的變化，即在Ⅰ型超敏反應中，存在由免疫系統所介導的致敏過程，只有當過敏原二次與機體接觸后才能引發相關反應，而類過敏反應的發生則無需免疫系統介導，在過敏原物質首次接觸機體后就可以發生。這一點的測定可以在實驗早期幫助區分致敏原的根本性質，指導臨床用藥。而對其過敏原的確證和作用機制的明確，能更好的認識TCMI不良反應的本質，從而找到更好的解決中藥注射劑不良反應的方法，保障安全用藥。此外，無論是早期對青霉素過敏性反應的研究，還是后來對TCMI的過敏性反應的相關研究，都存在Ⅰ型超敏反應和類過敏反應2種結論。基于這一特點，本文提出了一種新的假設，既然對一種藥物或物質引發不良反應的機制探索中，同時存在了2種可能的結論，那么一種物質是否能夠同時引發這2種反應呢?現有的研究資料通常都沒有關注這一事實，將2種反應割裂開研究，而針對上述出現的現象，建議，或許未來的研究中，對于同一種物質可同時建立2類反應的動物或細胞模型，更加全面的展開相關研究。
作者：范瀟予1；林琳1；魏金鋒1，2；靳洪濤1，2 單位：1.中國醫學科學院藥物研究所新藥安全評價研究中心，2.北京協和建昊醫藥技術開發有限責任公司
